发布时间：2025-09-28
在流式细胞术实验中，准确区分活细胞与死细胞是确保数据可靠性的关键第一步。死细胞会非特异性结合抗体，导致假阳性结果，严重干扰数据分析。培镨生物将为您的实验提供一份清晰的攻略，帮助您根据实验需求选择最合适的死活染料。
一、 为什么死活染色是流式实验的“守门员”？
活细胞具有完整的细胞膜，而死细胞或凋亡细胞的细胞膜通透性会增加。死活染料正是利用这一根本差异来区分细胞状态。如果不进行死活染色，死细胞带来的“噪音”信号会：
- 增加背景荧光，降低实验的信噪比。
- 导致假阳性，误将死细胞的非特异性吸附解读为特异性信号。
- 影响细胞分群，使数据分析变得困难，甚至得出错误结论。
因此，进行死活染色并设门（Gating）排除死细胞，是流式数据分析和解读的黄金标准。
二、 主流死活染料的工作原理与分类
目前主流的死活染料主要分为两大类，其原理和特性截然不同。
1. 膜完整性染料（经典方法）
这类染料不能透过活细胞的完整细胞膜，但可以进入膜受损的死细胞，并与细胞内的核酸（DNA/RNA）结合而发出强荧光。
- 代表染料： 碘化丙啶（PI）， 7-氨基放线菌素D（7-AAD）
- 优点： 成本低、使用简便、染色快速。
- 致命缺点： 不能用于固定或破膜后的细胞，因为固定破膜处理会使所有细胞的膜通透性增加，导致活细胞也被染色，从而失去区分能力。
- 适用场景： 仅对新鲜、未经固定的细胞进行表面标记分析的成本敏感型实验。
2. 胺反应性染料（尤其适用于多色实验）
这类染料是反应性荧光分子，能与细胞蛋白质中的自由氨基（-NH2）共价结合。
工作原理：
- 活细胞： 细胞膜完整，染料只能与细胞表面的氨基结合。由于表面氨基数量有限，染色信号较弱。
- 死细胞： 细胞膜受损，染料可自由进入细胞内，与胞内大量蛋白质的氨基结合，产生非常强的荧光信号。
- 核心优势： 染色信号在细胞固定和破膜后依然稳定，因此完美兼容细胞内因子（如细胞因子、转录因子）染色实验。
- 代表染料： 各品牌推出的可固定死活染料，如 BD的Fixable Viability Stain系列，Invitrogen™的 LIVE/DEAD™ 系列， BioLegend 的 Zombie dyes， Thermo Fisher 的 eFluor™ 系列。
代表染料
| Description | Excitation（nm） | Emission（nm） | Laser | Fluorescence Channel | 加入DMSO体积（uL） |
| BD Horizon Fixable Viability Stain 440UV | 338 | 436 | UV | DAPI | 363 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 450 |
406 | 450 | Violet | V450，Pacific Blue，BV421 | 400 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 510 |
408 | 512 | Violet | V500，BV510 | 260 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 575V |
396 | 572 | Violet | BV605，Pacific Orange | 340 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 520 |
498 | 521 | Blue | FITC，Alexa Fluor488 | 130 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 570 |
547 | 573 | Yellow-Green/Blue | PE | 220 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 620 |
523 | 617 | Yellow-Green/Blue | PE-CF594 | 230 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 660 |
649 | 660 | Red | APC，Alexa Fluor647 | 190 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 700 |
657 | 700 | Red | APC-R700，Alexa Fluor700 | 310 |
|
BD Horizon Fixable Viability Stain 780 |
759 | 780 | Red | AP-Cy7 | 180 |
| *Do not use reagent conjugated with these fluorochromes in the same tube. | |||||
三、 进阶技巧：如何选择可固定死活染料的颜色？
当您选择了可固定死活染料，下一步就是为其挑选合适的荧光颜色。这是多色流式 panel 设计成功的关键。 黄金法则：将最亮的荧光通道留给您最想检测的抗体，避免死活染料信号溢出到其他通道。
优先选择远红外染料（如 eFluor 780, APC-Cy7）：
原因： 大多数流式抗体在远红外通道的荧光强度相对较弱。将死活染料放在这个通道，可以避免其明亮的信号“淹没”邻近通道的弱阳性信号。同时，您可以将更明亮的通道（如 FITC, PE）留给难以检测或低表达的目标抗原。
避开您 panel 中的“明星”抗体通道：
示例： 如果您要检测某个低表达的关键受体，并用PE（非常亮）标记的抗体来检测它，那么死活染料就应避免使用也被561 nm激光激发的染料（如PE-Cy5），以免光谱重叠带来补偿难题。
四、 结语与黄金法则
选择合适的死活染料是流式实验设计的基石。总结来说，我们强烈建议：
- 对于绝大多数现代流式实验，尤其是涉及细胞内染色或多色分析的实验，可固定死活染料是更优乃至必需的选择。
- 在设计多色流式 panel 时，应遵循“先定死活染料，再搭抗体”的原则，优先为死活染料分配一个不易冲突的通道（如远红外通道）。
- 希望这份攻略能帮助您优化实验流程，获得更纯净、更可靠的流式数据。如果您对特定染料或实验方案有进一步疑问，欢迎联系培镨生物的技术支持团队！
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