发布时间：2025-09-30
所需试剂和材料
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产品名称 |
产品名称缩写 |
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BD Pharmingen™ Stain Buffer with BSA or BD Pharmingen™ Stain Buffer with FBS |
Stain Buffer |
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Microwell plates (round bottom wells) or 12 x 75-mm polypropylene round bottom tubes |
plates or tubes |
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Fluorescent antibodies |
antibodies |
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Centrifuge |
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可选试剂
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产品明场 |
产品明场缩写 |
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Human BD Fc Block™ |
Fc Block |
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Labeled secondary antibodies |
secondary antibodies |
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Labeled streptavidin conjugates |
streptavidin conjugates |
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BD Cytofix™ buffer |
BD Cytofix buffer |
注意事项
对于外周血单个核细胞（PBMC）制备，可以使用金准ImmunoSep密度梯度细胞分离液。
•对于大多数应用，BSA作为阻断封闭剂就足够了，但如果需要更严格的阻断，可以使用FBS。
•抗体染色前不需要清洗。
•确定最佳抗体浓度可能是必要的。对于大部分抗体产品，添加推荐的抗体体积。根据荧光抗体的亲和力，染色时间可延长（约45分钟）。
•如果分析必须延迟，那么染色的细胞可以用多聚甲醛或者固定缓冲液固定（例如，BD Cytofix缓冲液，详细方案见产品）在4°C下固定30分钟，洗涤，在Stain buffer中重悬，然后在4°C下保存（避光）。应尽快对固定细胞进行分析。我们还没有对所有的荧光结合抗体进行检测。因此，研究人员可能需要验证这种固定是否会影响抗体结合和荧光强度。
染色流程：
1.如有必要，用Stain Buffer重悬pbmc或细胞系。
2. 在预冷的Stain Buffer中清洗细胞两次，离心条件：4°C，300 x g。
3. 用预冷的Stain Buffer将细胞重悬至终浓度为2 × 10^7 Cells/mL。
4. 将100µL的细胞悬液（10^6个细胞）分装到流式管或平板的圆底孔中。
5. （可选）阻断非特异性Fc介导的相互作用，每管（或每孔）每10^6的pbmc中加入2.5 μg Fc block，室温孵育10分钟。
6.向细胞中加入抗体，避光在冰上孵育30分钟。
7. 用200µL（对于孔板）或1 ml（对于流式管）的Stain Buffer洗涤细胞两次。300g离心细胞5分钟。
8. 小心地抽吸（对于微孔板或微孔管）或反转并吸干（对于微孔管）细胞颗粒上清液。
9. 轻敲管/板使细胞松动。
10. 对于细胞的间接免疫荧光染色，用二抗或链霉亲和素偶联物在100µL的染色缓冲液中重复步骤5和6。
11.用200µL（针对微孔板）或0.5 ml（针对流式管）体积的Stain Buffer重悬细胞。
12. 流式细胞术分析染色细胞样本。
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