TSA多色免疫标记注意事项1

发布时间：2026-04-30

抗体的选择

●一抗选择：选择好用的一抗及其组合，TSA多色荧光标记成功了一半！那么我们该选择怎样的抗体呢培镨生物跟您仔细讲讲

1. 选择用于临床病理诊断的抗体。
2. 选择文献报道的抗体。
3. 尽量选择单抗，谨慎选择多抗。
4. 小鼠标本不要选择小鼠来源的一抗（细胞染色除外）。
5. 石蜡样本推荐Abcam标注IHC-P的抗体，尤以KO-VALIDATED （敲除验证）为佳。

●二抗选择：好的二抗也尤为重要

1. 使用经过预吸附（也称交叉吸附）的二抗，以降低潜在物种交叉反应导致的非特异性背景，这对免疫细胞丰富的样本尤其重要。
2. 尽量选择HRP直接标记的二抗：节省实验流程，提高特异性。
3. 选择HRP多聚体二抗，可显著提高信噪比。

4.       利用阳性样本进行抗体特异性验证：具有专业知识背景很重要！

5. 查阅发表文献，获知抗原表达及抗体特异性的关键信息。
6. 建议从DAB显色的IHC开始。
7. 根据信号的组织定位、细胞定位、胞膜/胞核/胞浆/细胞器定位，综合验证抗体特异性。
8. 记录获得最佳信号的一抗浓度、孵育时间和温度，二抗孵育时间，显色时间等关键信息。

荧光染料选择

●TSA信号放大原理：了解背景知识，帮助我们得到更好的实验结果

1、TSA:HRP酶促反应在线性期内(0~T2)可持续活化1 0-1 000个荧光分子，反应最终饱和，进入平台期(T2-T3)。平台期之后，不同位点之间信号的差异会被逐渐拉平。

以CEP1 64的表达为例:CEP1 64在细胞中心体中高表达，在睫状囊泡中低表达，但在TSA标记过程中，过长反应时间(1 5 min)缩小了这种差异，让睫状囊泡中的信号看起来和中心体一样强。

由此可见,TSA对于低丰度靶点的检出具有巨大优势，但也要考虑信号放大过度造成的影响：

1. 对于中高丰度靶点，请从原一抗浓度1 /1 0-1 /5开始测试使用TSA。

2. 细胞实验请将TSA从1 :20~50稀释开始测试。

3. 设置反应时间梯度，记录最佳反应时间。

4. 如需考虑表达差异，应在T2之前中止反应。

2、TSA的占位效应

TSA荧光化合物在HRP催化下发生活化，与靶点附近的酪氨酸残基结合生成稳定的荧光化合物。

在多色标记过程中，当两个靶点抗原距离接近时，上一轮反应将抗原附近的酪氨酸耗竭，导致下一轮荧光结合不上的问题，称为占位效应。

1.  TSA荧光化合物的作用半径为5~1 0nm,半径外的占位效应不会发生。

2.  组织中的酪氨酸位点较为丰富，占位效应并不经常发生。

3. 占位效应通常发生在距离接近且表达差异较大的靶点之间，例如PD1 和CD3,如果先做CD3并且信号放大过度，确实会导致PD1 染色弱甚至染不上的问题；某些表达广泛且丰度高的靶点，例如外源性表达的GFP分子，在信号放大过度时也可能会耗竭整个细胞的酪氨酸位点。

解决办法：“先低后高”、“先少后多”和适度原则：先染丰度低、表达范围少的靶点，后染丰度高、表达范围广的靶点。

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