发布时间：2024-09-18
不同类型的小鼠脑样本适用不同的RapiClear组织透明试剂，具体参照下表：
| 样本类型 | 样本厚度 | RapiClear（RC） | 透明时间 | 备注 |
| 切片 | ＜500um | RC1.47 | 数小时 | - |
| 500-1000um | RC1.49 | 数小时 | - | |
| ＞1000um | RC CS | 数周 | 需与CLARITY配合使用 | |
| 整脑 | RC1.55 |
数周 |
需与ScaleB4 Solution一起用 | |
| RC CS | 数周 | 抗体染色效果与透膜厚度yougu | ||
1.麻醉小鼠，并使用预冷1xPBS每分钟20mL灌注小鼠，直到流出的PBS无色为止。
2.用预冷的4%PFA灌流固定，剥离脑组织并将其浸泡20mL PFA中。
3.将脑组织置于PFA，4℃轻轻振荡过夜
4.用PBS清洗组织，置于摇床室温20min。
5.脑组织可通过振荡切片机，冷冻切片或组织切片模具手动切片。
6.将切片置于12孔板中，加入4%PFA，室温处理2小时。
7.用PBS室温洗涤3次。
8.将样本转移至2%PBST溶液（含2%Triton-X 100），室温过夜透化。
9.可选步骤：免疫染色
9-1.加封闭缓冲液，置于振荡器或摇床4℃过夜。
9-2.加入一抗置于摇床，4℃孵育3-5天。（具体孵育时间可根据抗体厂家建议）
9-3.室温清洗样本，两次，每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液（含3%NaCl和0.2%Triton-X 100 PBS）4℃摇床过夜
9-4.加入二抗，置于摇床，4℃孵育1-2天。（具体孵育时间可根据抗体厂家建议）
9-5.室温清洗样本，两次，每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液4℃摇床过夜。
10.可选步骤：DAPI染色
10-1.加入DAPI，4℃摇床过夜。
10-2.用PBS清洗样本3次，每次20min，将样本置于新鲜PBS，4℃摇床过夜。
11.用无尘纸吸去样本表面多余的PBS。
12.加入1mLRapiClear1.47或RapiClear1.49透明试剂（透明试剂可重复使用，不要超过3次），置于摇床，数小时后观察透明程度。37℃预热透明试剂可有助于试剂渗透，样本透明后可进行观察，或置于室温数周不影响成像品质。
13.将iSpacer粘在载玻片或盖玻片上，将样本置于iSpacer孔内，加入新鲜透明试剂，盖上盖玻片。用无尘纸吸去iSpacer周围多余液体，封片。
14.用共聚焦显微镜 或双光子显微镜观察。