人 CD4辅助性T细胞

发布时间：2025-04-02

1.辅助性T细胞

辅助性T细胞（Helper T cells，简称Th细胞）是免疫系统中一类关键的淋巴细胞，它在适应性免疫中起关键作用。抗原识别后，初始TH细胞被激活，进行进一步分化，并分泌细胞因子来促进（“帮助”）和引导免疫反应。所有的TH细胞CD4都呈阳性，CD4是一种辅助受体，与T细胞受体（TCR）互补，与抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）交流。

2.来自外周血的CD4 辅助性T细胞

在人类外周血中，所有CD45+白细胞中有15-30%是T细胞，其中CD4+ T细胞约占T细胞总数的三分之二，CD8+ T细胞占其余三分之一。在分离的pbmc中，T细胞占细胞总数的45-70%，因此是迄今为止最丰富的细胞类型。CD4+ T细胞占pbmc总数的60%，CD8+ T细胞占30%。

CD4 TH细胞亚群

亚型	分泌细胞因子	功能
TH1	IFN-γ，IL-2，TNF-α	•促进细胞免疫反应 •激活巨噬细胞 •促进细胞毒性T细胞的增殖
TH2	IL-4，IL-5，IL-6，IL-13	•促进体液免疫反应 •激活B细胞扩增和抗体生产
TH17	IL-17A，IL-7F，IL-21，IL-22，IL-26	•保持粘膜屏障 •支持粘膜表面的病原体清除
TH9	大量IL-9，IL-10	•重要的各种炎症情况：哮喘，溃疡性结肠炎，寄生虫感染
TH22	IL-13，IL-22，TNF-α	•主要在皮肤上招募，有助于宿主防御微生物病原体 •影响上皮细胞和基质细胞 •促进组织修复和重塑
Tfh	IL-6，IL-10，IL-21，IL-12	•对生发中心形成、亲和力成熟和大多数高亲和力抗体和记忆B细胞的发展至关重要

人类T细胞从naive T细胞向记忆T细胞分化（PMID: 24258910, 26999211）。

3.外周血样本制备

培镨生物提供各种试剂盒，可用于从外周血和血液制品中直接分离CD4+ T细胞。使用这些试剂盒时不需要特定的样品制备。CD4+ T细胞也可以从PBMC中分离出来，可以通过密度梯度离心或使用MACSprep™PBMC分离试剂盒。

4.从全血，Buffer coat，LRSC， Leukopak分离CD4+ T细胞

样本	分离类型	描述	产品
Pan CD4+ T细胞
全血	阳性分选	适合小体积样本（总体积：40mL全血）	StraightFrom® Whole Blood CD4 MicroBeads, human
Buffer coat	阳性分选	可以直接处理整个Buffer coat（高达80mL）无需密度离心，包括所需的柱子。	StraightFrom Buffy Coat CD4 MicroBead Kit, human
LRSC	阳性分选	可以直接处理整个LRSC（高达40mL）无需密度离心，包括所需的柱子。	StraightFrom LRSC CD4 MicroBead Kit, human
Lenkopak	阳性分选	可以直接处理½LeukoPak，无需密度离心，包括所需的柱子。	StraightFrom® Leukopak® CD4 MicroBead Kit, human
全血	去除分选	在30分钟内直接从全血中分离CD4+ T细胞（总容量：3x30ml全血）	MACSxpress® Whole Blood CD4 T Cell Isolation Kit, human
Buffer coat	去除分选	在不到30分钟的时间内直接从整个Buffer coat中分离CD4+ T细胞。
LRSC	去除分选	在不到30分钟的时间内直接从LRSC（最多40 mL）中分离CD4+ T细胞。	MACSxpress Buffy Coat CD4 T Cell Isolation Kit, humanMACSxpress LRSC CD4 T Cell Isolation Kit, human
naive/memory 亚型
全血	去除分选	在30分钟内直接从全血中分离CD4+CD45RO+细胞（总容量：3x30ml全血）。	MACSxpress Whole Blood CD4 Memory T Cell Isolation Kit, human

StraightFrom®MicroBead试剂盒可用于直接从全血、Buffer coat、LRSC或Leukopak®中快速阳性选择靶细胞。不需要任何样品制备，如密度离心，红细胞溶解，或细胞计数。根据起始样本选择合适的试剂盒。

使用StraightFrom Buffy Coat CD4 MicroBead Kit，人类CD4+细胞可以在不到30分钟内从整个Buffy Coat中分离出来。该试剂盒可与QuadroMACS™分离器结合使用进行手动分离，但最好与 MultiMACS™ Cell24 Separator Plus结合使用。

应用案例

StraightFrom Buffy Coat CD4 MicroBead Kit, human

分离前                                                                 分离后 

                                

直接从Buffer coat分离CD4+ T细胞。使用StraightFrom buffy coat CD4 MicroBead试剂盒和带单柱适配器和全血柱的 MultiMACS™ Cell24 Separator Plus 分离Buffer coat。用CD4-PE、CD14-APC和CD45-VioBlue®对细胞进行荧光染色，并使用MACSQuant®分析仪进行流式细胞术分析。细胞通过CD45-VioBlue触发。基于散射信号和碘化丙啶荧光的分析排除了细胞碎片和死细胞。

高纯度未标记CD4+ T细胞。使用MACSxpress全血CD4 T细胞分离试剂盒、MACSmix™管旋转器和MACSxpress分离器从30ml人edta抗凝全血中分离未标记CD4+ T细胞。

5.从PBMCs中分离CD4+T细胞

起始样本	分离类型	描述	产品
PBMCs	阳性分选	CD4主要在TH细胞上表达。适合于从PBMC去除或富集CD4+细胞。	CD4 MicroBeads, human
PBMCs	阳性分选随后释放标记物	该试剂盒可以分离无标记的CD4+细胞，因为分离后可以从细胞表面释放完整的标记复合物。	REAlease CD4 MicroBead Kit, human
PBMCs	去除分选	通过去除CD8+ T细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、树突状细胞、NK细胞、粒细胞、TCRγ/δ+ T细胞和红细胞分离CD4+ TH细胞	CD4+ T Cell Isolation Kit, human

与直接处理全血或血液制品不同，样品需要通过密度梯度离心处理，预富集外周血单个核细胞（PBMCs），作为后续TH细胞分离的起始材料。

应用案例：

                              PBMCs分选前                                                                    分选后

                                                                          

pbmc中未标记CD4+ T细胞的分离。使用CD4+ T细胞分离试剂盒、LS柱和MidiMACS™分离器对样品进行处理。用CD4-PE和CD3-FITC标记细胞，用MACSQuant分析仪进行流式细胞术分析。

REAlease® CD4 MicroBead Kit, human

1）细胞纯度

                              分选前                                                                   分选后

                                                             

无标记，高纯度CD4+ T细胞。

使用REAlease CD4 MicroBead试剂盒、分选柱和MiniMACS分离器从人外周血中分离CD4+ T细胞。用CD4-FITC对细胞进行荧光染色，用MACSQuant Analyzer x进行流式细胞术分析。根据散射信号和碘化丙啶荧光排除细胞碎片和死细胞。

2）无标记细胞：释放生物素复合物

                                              分选前                                                 无MicroBeads的CD4+细胞                                    释放生物素复合物后

                                                                                        

通过使用Anti-Biotin-APC流式细胞术分析细胞中释放生物素复合物的存在，可以有效地去除所有标记。分离后，细胞直接显示生物素染色（无microbead的CD4+细胞），而释放释放生物素复合物后无标记的CD4+细胞与分离前未标记的细胞相似，生物素呈阴性。释出抗生素微珠（CD4）的释放效率大于99%。

6.从PBMCs中分离初始/记忆CD4+TH细胞亚型的试剂

起始样本	分选类型	描述	产品
PBMCs	去除分选	通过去除CD45RO+和非T细胞分离所有初始CD4+ T细胞。	Naive CD4⁺ T cell Isolation Kit II, human
PBMCs	去除分选	通过去除CD45RA+和非t辅助细胞分离所有记忆性CD4+细胞。	Memory CD4⁺ T cell Isolation Kit, human
PBMCs	去除分选	通过去除非T辅助细胞、CD45RA+细胞和CCR7+细胞分离所有CD4+效应记忆T细胞。	CD4⁺ Effector Memory T cell Isolation Kit, human
PBMCs	逐步分离	去除非CD4+细胞和初始CD4+ T细胞，然后基于CD197分离Tcm。	CD4⁺ Central Memory T cell Isolation Kit, human
PBMCs	阳性分选	CD62L （L-Selectin）是一种初始/早期记忆T细胞标志物。	CD62L MicroBeads, human (after pre-selection with CD4⁺ T cell Isolation Kit, human)
PBMCs	阳性分选	CD45RA在初始T细胞上表达，而在记忆T细胞上不表达	CD45RA MicroBeads, human (after pre-selection with CD4⁺ T cell Isolation Kit, human)
PBMCs	阳性分选	CD45RO在记忆T细胞上表达，而在初始T细胞上不表达	CD45RO MicroBeads, human (after pre-selection with CD4⁺ T cell Isolation Kit, human)

应用案例：

a）Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human 

                                       分选前                                                                                 分选后

                                                                                  

从PBMCs中分离未标记初始CD4+ T辅助细胞。使用Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human 、LS柱和midmacs分离器对样品进行处理。细胞用CD4和CD45RA抗体染色。

b）Memory CD4+ T Cell Isolation Kit, human

                                             PBMCs分选前                                                      未标记CD4+记忆T细胞

                                                                      

pbmc未标记记忆CD4+ T辅助细胞的分离。使用Memory CD4+ T Cell Isolation Kit, human、LS柱和midmacs分离器对样品进行处理。细胞用CD4和CD45RO抗体染色。

c）CD62L MicroBeads, human

分选前                                                     去除CD62L+细胞                                    阳选选择CD62L+细胞

                                       

使用CD62L MicroBeads, human从PBMCs中分离CD62L+细胞。阳性选择采用MS柱和MiniMACS™分离器分离CD62L+细胞。为了去除CD62L+细胞，样品在midmacs分离器的LD柱上分离。

7.从PBMCs中分离其他CD4+T细胞亚型

T细胞亚型	分离类型	描述	产品
TH2	直接分离目标细胞	CD294 （CRTH2）是TH2细胞的标志物。	CD294 (CRTH2) MicroBead Kit, human
皮肤归巢T细胞	直接分选目标细胞	皮肤淋巴细胞相关抗原（CLA）是皮肤归巢T细胞的标志物	Anti-CLA MicroBead Kit, human
皮肤归巢CD4+T细胞	逐级分选	首先分离CD4+ T细胞，然后选择表达皮肤归巢受体CLA的细胞	Combine: CD4+ T Cell Isolation Kit, human Anti-CLA-PE, human (clone HECA-452) Anti-PE MicroBeads
近期胸腺输出T细胞（RTEs）	逐级分选	首先，非CD4+细胞和记忆CD4+ T细胞被去除。然后通过CD31分离RTEs。	CD4+ Recent Thymic Emigrant Isolation Kit, human

8.CD4+T辅助细胞流式表达

CD4+ T细胞亚群及其分化状态可通过流式细胞术根据其细胞表面标记物、转录因子及其产生的细胞因子的表达来确定。培镨生物提供流式抗体各大品牌广泛的常规抗体和重组REAfinity™抗体组合，用于全面分析。

人TH细胞亚群和相应的极化细胞因子、表面标记物、转录因子和分泌细胞因子。

流式panels

以下表面标记物、细胞因子和转录因子可用于流式细胞术鉴定CD4+ T细胞亚群。

T细胞发育-初始 vs. 记忆（Tscm/Tcm/TEM/TEMRA）	CD4+TH亚型（TH1/TH2/TH9/TH17/TH22/TFH）	刺激TH细胞	去除TH细胞
CD3	CD3	CD3	CD3
CD4	CD4	CD4	CD4
CD8	CD161（NK1.1）	CD8	CD8
CD27	CD183(CXCR3)	CD25(IL2RA)	CD96(TACTILE)
CD28	CD184(CXCR4)	CD27	CD152(CTLA-4)
CD45RA	CD185(CXCR5)	CD28	CD160(NK1)
CD45RO	CD194(CCD4)	CD69	CD223(LAG-3)
CD57	CD196(CCR6)	CD95(FasR)	CD244(2B4)
CD62L(L-Selectin)	CD197(CCR7)	CD134(OX40)	CD278(ICOS)
CD95(FasR)	CCR10	CD137(4-1BB)	CD279(PD1)
CD127	IL-2	CD154(CD40L)	CD366(TIM-3)
CD197(CCR7)	IL-4	Ki-67	TIGIT
	IL-5	KLRG1	VISTA
	IL-9		EOMES
	IL-10		CD272(BTLA)
	IL-13
	IL-17
	IL-21
	IL-22
	IL-26
	IFN-γ
	T-bet
	RORγT
	GATA2

9.细胞因子分析

T细胞相关表面标记物和细胞因子的分析提供一系列解决方案：

a）MACS Cytokine Secretion Assays可以检测和富集活细胞因子分泌细胞。人类试剂盒可用于大量细胞因子，包括TNF-α， GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13， IL-17和IL-22，并可用于进一步表征TH细胞亚群

细胞因子分泌试验原理-细胞富集和检测试剂盒。

b）MACSPlex 12 Cytokine Kits 用于使用标准流式细胞仪对血清和细胞培养上清中的分泌细胞因子进行多重分析。可在单个样品中分析的细胞因子包括：GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、il -2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-17A和TNF-α。

MACSPlex检测的原理。含有未知水平分析物的样品与抗体包被的MACSPlex (MPx) Capture Beads孵育，分析物与特定抗体结合。加入MPx检测试剂，由apc偶联抗体的鸡尾酒组成，用于分析物特异性。因此，夹心复合物在MPx捕获珠、分析物和MPx检测试剂之间形成。这些配合物可以根据MPx捕获头和检测试剂的荧光特性进行分析。该试剂盒提供给定分析物已知量的标准物，用于未知样品中分析物的定量。

10.CD4+T辅助细胞的培养

a）TexMACS™Medium是一种专为T细胞开发的无血清细胞培养基。它已被用于各种应用，并与MACS细胞因子相结合，是可靠培养条件的理想起点。

人T细胞在不同培养基中扩增率的比较。使用 T Cell Activation/Expansion Kit, human.，在TexMACS培养基（竞争产品）和含有基础培养基（RPMI + 10% FBS）的血清中扩增细胞。

b）T Cell TransAct™是一种即用型试剂，可按体积应用，无需原代细胞比计算。多余的试剂只需通过培养洗涤除去。T Cell TransAct可用于研究和GMP等级，可将工作流程无缝转移到临床环境中。

活化纯化后的人T细胞。使用 Pan T Cell Isolation Kit分离的T细胞在添加人IL-2的TexMACS培养基中使用T Cell TransAct活化48小时。用MACSQuant分析仪对细胞进行荧光染色和流式细胞术分析。

c）T Cell Activation/Expansion Kit, human是基于大细胞尺寸的颗粒装载生物素化抗体的选择，以激活和扩增原代细胞。当装载CD2， CD3和CD28抗体并以特定的头细胞比应用时，大细胞尺寸的颗粒模拟抗原呈递细胞并导致有效的T细胞活化。

d）CytoStim™是一种基于抗体的试剂，可快速刺激T细胞。它可以作为SEB的无毒替代品，例如，用于抗原特异性T细胞刺激试验或细胞内细胞因子染色实验的阳性控制，以检测细胞因子或激活标记物的表达。

不同T细胞刺激试剂的比较。用CytoStim、SEB或PMA/ iononomycin刺激新分离的人外周血单核细胞4小时。细胞随后用CD4、CD154和抗IFN-γ抗体染色，并在CD4预门控后分析CD154和IFN-γ的表达。