发布时间：2024-09-23
传统药物开发倚靠着人源肿瘤细胞系进行高通量筛选。令人沮丧的是人源肿瘤细胞系经长期体外培养后，其肿瘤细胞基因图谱、蛋白质表现、肿瘤异质性都与原始肿瘤组织存在很大差异。经多年验证，此模型与临床相关性不到5%，从而在预测临床药效方面不理想。
面对如此难题，科学家们开发出人源肿瘤组织来源移植瘤模型 (patient derived xenograft, PDX) ；通过将病人新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的肿瘤模型，建成的这个模型保留了这个肿瘤患者的组织型和遗传学的特征，并且维持了肿瘤的异质性。这种模型跟临床的药效学结果有极高的相关性（~90%），所以它们被广泛的应用到药物研发当中。接下来，培镨生物为您介绍关于PDX更多知识。
PDX最大的优势：保留了肿瘤异质性，更符合临床肿瘤特征
1.移植所用样本直接取自人体肿瘤组织，稳定保留肿瘤的遗传特性，组织学和表型特征，及肿瘤异质性；
2.PDX亦可用于筛选化疗药物敏感或耐药标记物，其试验结果具有较好的临床预见性，可作为二三线临床用药指导；
3.PDX在移植过程中较好地保留了肿瘤间质和干细胞成分，使得肿瘤的生长微环境更接近实际情况，还可为肿瘤样本的保存和传代提供大量标本等。
PDX模型在药物筛选和临床前治疗评估中的应用。Adapted from Journal of Hematology & Oncology.
PDX在给药处理一段时间后会取出肿瘤做实验下游分析，如抽取tumor DNA进行NGS，使用流式细胞仪分析肿瘤细胞表征，甚至体外细胞培养进行药物敏感性测试。然而此时人源肿瘤组织周边会混和着不定程度鼠源的间质细胞 (stroma cells) 、周细胞 (pericyte)、甚至有血管增生。这些浸润混合的鼠源” 污染细胞” 对人源肿瘤组织产生更多非必要的异质性与造成实验结果偏差。因此，能有效地从患者衍生的异种移植肿瘤去除小鼠细胞是PDX model下游分析或培养应用一重大环节。
非小细胞肺癌(NSCL) PDX model，不同肿瘤组织存在着不定程度的小鼠细胞量。
美天旎提供温和解离肿瘤组织、
最大程度保留肿瘤细胞表面分子标记
以及去除小鼠细胞的完整解决方案
I. 肿瘤解离 (Tumor dissociation)
（1） 自小鼠体内取出人源肿瘤，将脂肪、纤维与坏死区域先去除；并切割成2–4 mm大小。转移小碎片的肿瘤组织到含有消化酶的gentleMACS C Tube。
（2） 将C Tube倒放在gentleMACS Dissociator，选择适当程序进行解离以获得单颗细胞。
（3） 重悬单颗细胞混合液并通过MACS SmartStrainer (30 μm or 70 μm) 去除残余团块碎片。短暂离心 (300g, 7min, RT) ，吸弃上清，重悬单颗肿瘤细胞于5 ml PB buffer。
附注1：若细胞混合液粘稠，表示有DNA释放；可执行DNase treatment。
附注2：若要移除红细胞，可使用红细胞分解液 (# 130-094-183)。若要去除死细胞或细胞碎片，可使用Dead Cell Removal Kit (# 130-090-101) 或 Debris Removal Solution (# 130-109-398)。
II. 去除小鼠细胞 (Mouse Cell Depletion using Magnetic Cell Separation)
（1） 以台盼蓝（Trypan Blue) 染色计数活细胞，重悬细胞于1x107 cells/80ul PB buffer。
附注：此时需以台盼蓝（Trypan Blue) 染色在显微镜下计数活细胞，而不可用Cell Counter。因为组织解离后的单细胞呈现多样性，利用Cell Counter计数无法获得正确的活细胞数目。
（2） 将细胞与标记小鼠细胞的磁珠混合，放置2−8 °C的冰箱孵育15分钟。加入适当体积缓冲液，上样于分离柱。无标记的细胞先流出，此即为目标人源肿瘤细胞 （untouched tumor cells）。可利用缓冲液额外清洗管柱，已获得更多的肿瘤细胞量。
Untouched Selection
取得无标记的目标细胞
透过磁珠标记大部分不想要的细胞，为了使特定的目标细胞保持在untouched form，不会对目标细胞产生压力。
III．分离后的肿瘤细胞下游分析(Downstream Mouse Cell-free Human Tumor Cell Analysis)
（1） 使用独特的小鼠细胞分子标记（CD45/ HMCI）组合，可在人源肿瘤组织来源移植瘤模型(PDX)去除绝大部份小鼠细胞。
(2) 细胞碎片在磁珠分选时也被清除。
(3） 分离后的人源肿瘤细胞进行体外培养，可获得均质细胞族群。
(4) 分离后的人源肿瘤细胞执行RNA-Seq，明显获得更多可信的读值 (Read counts)
肿瘤组织解离后，仅需20分钟即可经由无标记方式分离出肿瘤细胞(Untouched isolation of tumor cells)，保留了最大程度的细胞表面抗原决定部位(cell surface epitopes)，更重要的是分离获得特定目标细胞进行下游实验，为您的实验研究得到高可信度与高品质的数据。
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