发布时间：2026-03-16
Th1细胞是重要的辅助性T细胞，由Th0细胞在IL-12等细胞因子作用下分化而成，可以通过产生干扰素-γ、白细胞介素（IL）-2和肿瘤坏死因子（TNF）-β，激活巨噬细胞，并复杂细胞介导的免疫和吞噬细胞依赖的保护反应。另外，T-bet被确定为Th1谱系的主转录因子，可直接调节IFNγ的产生。Th1细胞是帮助宿主防御细胞内病原体（包括原生动物、细菌和病毒）的关键角色，参与调节细胞免疫，辅助细胞毒性T细胞分化，介导细胞免疫应答，但也参与某些类型自身免疫性疾病的发展，包括类风湿关节炎、多发性硬化、急性肾移植排斥反应和原因不明的复发性流产等。
01 小鼠组织Th1极化方案
实验操作
一、从脾脏或淋巴结中富集CD4+ T细胞
1、分离小鼠脾脏或淋巴结
使用大约5~10周大小的雌性小鼠，通常每只小鼠可获得3~6x10^6个初始CD4+ T细胞。通常每只小鼠可获得3~6x10^6个初始CD4+ T细胞。从小鼠身上分别采集脾脏和淋巴结（颈浅、下颌、腋窝、腹股沟和肠系膜），放入收集盘中，在冰上执行所有后续步骤，直到分选后T细胞培养。
Tip：使用来自C57BL/6小鼠的细胞更好地产生Th1细胞。
2、组织样本处理
往放置脾脏或淋巴结的培养皿中加入适量PBS，用注射器结合无菌尼龙网轻轻磨碎组织；吹打悬液数次以打散细胞团块，使用70μm尼龙筛网过滤悬液以去除残留碎屑，补足PBS后离心处理，吸取上清液，将细胞重悬于PBS中；对于脾脏细胞，还需要进行红细胞裂解。
3、CD4 T细胞的富集
使用CD4磁珠分选试剂盒进行CD4 T细胞的富集；或者采用CD62L、CD44、CD25和CD4荧光偶联抗体对细胞进行标记后采用流式分选仪分选出初始CD4 T细胞。
二、Th1细胞的体外诱导分化
1、第0天：事先用Anti-Mouse CD3e，克隆号145-2C11（3ug/ml）和Anti-Mouse CD28，克隆号37.51（3ug/ml）或者克隆号11B11（10ug/mL）包被孔板，37℃孵育2h或者4℃过夜。然后轻轻吸出液体，用无菌PBS清洗3次，弃上清。
Tip：虽然通常采用的是CD3e包被细胞培养板、在培养基中添加CD28的方式活化CD4 T细胞，当然也有直接在培养基当中添加CD3e和CD28或者直接将CD3e和CD28包被细胞培养板的方法来活化CD4 T细胞，这几种方法都是可以有效活化细胞的。
2、对于24孔板，每孔加入1ml分离后的CD4 T细胞悬液（即1x10^6细胞/孔）。
3、选做：如果需要测试各种药物对细胞的影响，则根据具体实验，在诱导前、中、后将测试药物添加到相应孔中。
4、接下来，在培养基中加入相应量的细胞因子进行诱导：
Th1：Recombinant Mouse IL-2（5ng/mL），以及Recombinant Mouse IL-12 p70（10ng/ml），37℃ 5% CO2培养5天。
5、第3天，补加各孔2mL含有与第0天相同浓度的抗体/细胞因子的新鲜培养基，继续培养。
Note：上述浓度条件仅供参考，各实验室如有条件，尽量进行优化。
三、流式检测极化效果
1、收集细胞清洗一次，细胞重悬相应完全培养基中进行刺激：
Th1:50 ng/ml PMA，1ug/mL ionomycin以及monensin，37℃刺激4~6 h；
2、完成刺激后，收集细胞，进行流式染色实验。
实验结果
02人Th1极化方案
实验操作
一、从全血中富集Naive CD4 T细胞
1、采用密度梯度离心法从人外周血中分离PBMCs。
2、使用CD4磁珠分选试剂盒进行Naive CD4 T细胞的富集；或者采用CD45RA、CCR7和CD4荧光偶联抗体对细胞进行标记后采用流式分选仪分选出初始CD4 T细胞。
二、包被实验
用250ul/孔的Anti-Human CD3（克隆号 OKT3,2ug/ml）包被24孔细胞板，4℃过夜孵育；
三、CD4 T细胞的Th1极化诱导
1、用完全培养基重悬Naive CD4+ T细胞，调整浓度为0.5 X 10^6 cells/ml，加入以下诱导剂后，每孔接种1ml细胞。
Th1：1ug/ml anti-human CD28（克隆28.2），10ug/ml anti-human IL-4（克隆号MP4-25D2），5ng/ml Recombinant Human IL-12（p70）
注：完全培养基配方：RPMI 1640+10% FBS+100=100 U/mL Pen+100=100ug/ml Strep+2 Mm L-谷氨酰胺及非必须氨基酸。
2、在37℃含有5% CO2条件下培养7天；
3、第4天，更换含有80 ng/ml Recombinant Human IL-2的Th1极化培养基，然后1mL接种到预包被人CD3抗体的24孔细胞板中，在37℃含有5% CO2条件下继续培养3天；
4、收集细胞，PBS清洗两次，用1ml RPMI 1640完全培养基重悬；
5、加入2ul/ml Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug进行细胞刺激，在37℃含有5% CO2条件下孵育6h；
6、PBS清洗两次，收集细胞，通过流式检测检查诱导情况。
试剂列表
Sterile PBS
Cell culture Medium（RPMI 1640 supplemented with 10% FBS）
BD Pharm Lyse Lysing Buffer（Cat.No.555899）CD4 T-Lymphocyte Enrichment Set(Cat.No.558131)
BD Pharmingen Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e(clone 145-2C11,Cat.No.553057)
BD Pharmingen Purfied NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28(clone 37.51,Cat.No.553294)
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse IL-4(clone 11B11,Cat.No.554434)
BD Pharmingen Recombinant Mouse IL-2(Cat.No.550069)
BD Pharmingen Recombinant Mouse IL-12 p70(Cat.No.554592)
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)(Cat.No.554724)
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)(Cat.No.P81139 from Sigma)
BD Pharmingen Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3(clone OKT3,Cat.No.567118)
Naive CD4 T-Cell Enrichment Set(Cat.No.558521)
RPMI1640,10% FBS(2mM L-glutamine,100U/ml pen/strep,50uM β-mercaptoethanol,1mMsodium pyruvate)
BD Pharmingen Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28(clone 28.2,Cat.No.555725)
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Human IL-12(p70)(Cat.No.554613)
BD Pharmingen Recombinant Human IL-2(Cat.No.554603)
BD Pharmingen Leukocyte Activation Cocktail,with BD GolgiPlug(Cat.No.550583)